Determination of ochratoxin A in coffee by ELISA method and its relationship with the physical, physicochemical and microbiological properties / Determinación de ocratoxina A en café mediante método ELISA y su relación con las propiedades físicas, fisicoquímicas y microbiológicas

Background: Coffee is one of the most consumed beverages in the world; however, it may contain toxic compounds such as ochratoxin A (OTA). Objectives: Determine the OTA's presence in different types of coffee, intended for beverage preparation and marketed in Colombia through the application of the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and analyze its relationship with the physical, physicochemical and microbiological properties. Methods: 8 samples of coffee commercialized in the Colombian market were selected, in which the OTA content was determined by applying the ELISA method. Likewise, a microbiological analysis was performed, and physicochemical properties were determined, such as moisture content, aw, percentage total dissolved solids (%TDS), and extraction yield (%EY). Physical properties such as free-flow densities, compacted bulk densities (CBD), porosity, average particle size (ASP), and color. The data were treated with multivariate analysis using Principal Component Analysis (PCA) and Cluster Analysis (CA) to quantitatively investigate the relationships between the coffee samples concerning their physical, physicochemical properties, and OTA content. LSD test was applied with a significance level of 95 % and Pearson correlation test. Results:All the samples had OTA content, but only 2 exceeded the limits allowed by the regulations, with a maximum value of 15.449 µg/Kg, which represents 31.449 % of the tolerable daily intake according to the parameters defined by Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (JECFA). According to the PCA and CA, the samples were grouped harmonically according to the type of coffee associated with its commercial presentation and industrial process, OTA content, and ASP. OTA content was significantly and positively correlated (p< 0.05) with %EY, %TDS, ASP, porosity, CBD and moisture. Conclusions: The coffees marketed in Colombia showed a variable range of OTA, where soluble coffees had higher OTA contents than roasted coffees, and 25 % of the coffees analyzed do not meet the levels defined by Colombian regulations. The OTA content in coffee is related to properties that define the ability to extract solutes from coffee

Antecedentes: El café es una de las bebidas más consumidas en el mundo, sin embargo, puede contener compuestos tóxicos como la ocratoxina A (OTA). Objetivos: Determinar la presencia de OTA en diferentes tipos de café destinados a la preparación de bebida y comercializados en Colombia mediante la aplicación del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y analizar su relación con las propiedades físicas, fisicoquímicas y microbiológicas. Métodos: Se seleccionaron 8 muestras de café comercializado en el mercado colombiano, en las cuales se determinó el contenido de OTA mediante la aplicación del método ELISA. Así mismo se realizó análisis microbiológico y se determinaron propiedades fisicoquímicas como contenido de humedad, aw, porcentaje de sólidos disueltos totales (%TDS) y rendimiento de extracción (%EY); y propiedades físicas como densidad por caída libre, densidad compactada (CBD), porosidad, tamaño promedio de partícula (ASP) y color. Los datos fueron tratados con análisis multivariado empleando análisis de componentes principales (PCA) y análisis de conglomerados (CA) para investigar cuantitativamente las relaciones entre las muestras de café con respecto a sus propiedades físicas, fisicoquímicas y contenido de OTA. Se aplicó prueba LSD con un nivel de significación del 95 % y prueba de correlación de Pearson. Resultados: Todas las muestras presentaron contenido de OTA, pero solo 2 sobrepasaron los límites permitidos por la normatividad, con un valor máximo de 15.449 µg/Kg, el cual representa un 31.449 % de la ingesta diaria tolerable según los parámetros definidos por el Comité Mixto FAO/OMS de Expertos en Aditivos Alimentarios (JECFA). De acuerdo al PCA y CA, las muestras se agruparon armónicamente de acuerdo al tipo de café asociado a su presentación comercial y proceso industrial, contenido de OTA y ASP; el contenido de OTA se correlacionó significativa y positivamente (p < 0.05) con el %EY, %TDS, ASP, porosidad, CBD y humedad. Conclusión: Los cafés comercializados en Colombia presentan un rango variable de OTA, en donde los cafés solubles presentan contenidos de OTA mayores que los cafés tostados y el 25 % de los cafés analizados no cumplen con niveles definidos por la normatividad colombiana. El contenido de OTA en el café está relacionado con propiedades que definen la capacidad de extracción de solutos del café

Efecto antifúngico y antimicotoxigénico de Lactobacillus plantarum CRL 778 a diferentes valores de actividad de agua / Antifungal and antimycotoxigenic effect of Lactobacillus plantarum CRL 778 at different water activity values

Ochratoxin A (OTA) is a mycotoxin produced by filamentous fungi with high impact Lactic acid bacteria; in food safety due to its toxicity. In the last decade, the presence of OTA was widely reported in different foods. In this study, the ability of Lactobacillus (L.) plantarum CRL 778 to control growth and OTA production by Aspergillus (A.) niger 13D strain, at different water activity (a w) values (0.955, 0.964, 0.971, 0.982, and 0.995) was determined in vitro. Both parame ters were significantly (p<0.05) reduced by the lactobacilli and the effect depended on a w. Greatest growth rate inhibition (46.9%) was obtained at a w = 0.995, which is the most suitable value for growth and production of antifungal metabolites (lactic acid, acetic acid, phenyllac-tic and hydroxyl-phenyllactic acids) by L. plantarum CRL 778. Besides, morphological changes and inhibition of melanin synthesis were observed in colonies of A. niger 13D in presence of L. plantarum CRL 778 at a w ranged between 0.971 and 0.995. In addition, maximum reduction (90%) of OTA production took place at a w = 0.971, while inhibition of fungi growth was more evident at a w =0.995. These findings suggest that L. plantarum CRL 778 could be used for control of ochratoxigenic fungal growth and OTA contamination in different fermented foods with a w values between 0.971 and 0.995.

Ocratoxina A (OTA) es una micotoxina producida por hongos filamentosos con un alto impacto en la seguridad alimentaria debido a su toxicidad. En la última década se ha reportado ampliamente a nivel mundial, la presencia de OTA en diversos alimentos. En este estudio se evaluó in vitro, la capacidad de Lactobacillus (L.) plantarum CRL 778 de controlar el crecimiento y la producción de OTA por Aspergillus (A.) niger 13D, a diferentes valores de actividad de agua (a w): 0.955, 0.964, 0.971,0.982 y 0.995). La cepa láctica redujo significativamente (p <0.05) ambos parámetros, siendo el efecto dependiente del valor de a w. La mayor inhibición del crecimiento (46.9%) se obtuvo a a w =0.995, valor más adecuado para el crecimiento y producción de metabolitos antifúngicos (ácido láctico, ácido acético, ácidos fenil-láctico e hidroxi-fenil láctico) por la cepa láctica. Además, se observaron cambios morfológicos en las colonias de A. niger 13D, crecidas en presencia de L. plantarum CRL 778 a valores de a w de 0.971 y 0.995. El porcentaje máximo de reducción en la producción de OTA (90%) por la cepa láctica se observó a un valor de a w = 0.971, mientras la inhibición del crecimiento fúngico fue mayor cuando a w = 0.995. Estos hallazgos sugieren que L. plantarum CRL 778 podría emplearse para el control de la contaminación por hongos ocratoxigénicos en alimentos con valores de aw comprendidos entre 0.971-0.995.

Determinación de ocratoxina-a por HPLC con detección por fluorescencia (HPLC-FL): un nuevo método estandarizado para muestras de trigo / Ochratoxin-a determination by HPLC with fluorescence detection(HPLC-FL): a new standardization method for wheat samples

El objetivo principal de este estudio fue evaluar la presencia de Ocratoxina-A (OTA) en los granos del trigo y harina del trigo realizadas por un nuevo método de determinación que usa la cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) acoplada al descubridor delfluorimetrio. El experimento usó seis muestras de grano de trigo del lugar del almacenamiento diferente a la industria local de Chapeco (SC), Brasil Sur, en agosto, 2008. El extracto de OTA era llevado a cabo usando el acetonitrila: agua (120:80 vlv) como solventes. Después el suprenadante fue filtrado, y aplicado en la columna del inmunoafinidad específica a OTA. Además, la columna se lavó con agua y la toxina era el eluido con el metanol. La determinación del OTA se realizó por detección de fluorescencia acoplado al aparato de HPLC. Los volúmenes de OTA en los granos del trigo y harina del trigo eran entonces los determínate y los resultados mostraron una concentración de OTA menor que los límites exigidos por la legislación internacional.

The main objective of this study was to evaluate the presence of Ochratoxin A (OTA) in wheat grains and wheat flour samples using a new high performance liquid chromatography (HPLC) method. The experiment used six wheat grain samples from different industry storage place from Chapeco (SC), South Brazil, on August 2008. The OTA extraction was carried out using acetonitrile: water (120:80 v/v) as solvent. Thereafter, the supernatant was filtered, and applied on OTA-specific immunoafinity column to HPLC Furthermore, the column was washed with water and the toxin was eluted with methanol. The OTA wheat grains and wheat flour concentration were analyzed by a fluorescence detector coupled to the HPLC apparatus. The results showed a smaller OTA concentration than the limits set by international legislation.

Fate of ochratoxin A content in Argentinean red wine during a pilot scale vinification / Evolución del contenido de ocratoxina A en vinos tintos argentinos durante el proceso de vinificación a escala piloto

The aim of this work was to evaluate the fate of ochratoxin A (OTA) content from must to wine during the red wine making process in a pilot scale vinification. The study was done using musts obtained from two red grape varieties (Bonarda and Tempranillo) artificially contaminated with two OTA levels. A duplicate set of tanks of 100 l each was established for each must (Bonarda and Tempranillo). The fermentations were initiated by inoculation of two Saccharomyces spp. strains having different fermentation performance. The must from the Tempranillo variety was spiked with 6 μg/l of OTA while that from the Bonarda variety with 0.3 μg/l of the toxin. Samples were collected at different stages of the process. Performance of the alcoholic and malolactic fermentations was monitored. Titratable and volatile acidity, pH, ethanol, sugar and SO2 concentrations were determined following standard methods proposed by the Office International de la Vigne et du Vin (OIV). OTA analysis was done by HPLC. Detection and quantification limits were 0.01 and 0.1 ng/ml, respectively. The OTA levels during the vinification trials dropped to an average of about 86.5%. The type of Saccharomyces strains used showed no effect on toxin reduction.

El objetivo del presente trabajo fue evaluar la evolución del contenido de ocratoxina A (OTA) en mostos durante un proceso de vinificación a escala piloto. Se utilizaron mostos de dos variedades de uvas tintas (Bonarda y Tempranillo) contaminados artificialmente con dos niveles distintos de OTA. El ensayo fue llevado a cabo por duplicado en tanques de fermentación de 100 l cada uno. La fermentación se inició mediante la inoculación de dos cepas de Saccharomyces spp. con diferentes características fermentativas. El mosto de la variedad Tempranillo fue contaminado con 6 μg/l de OTA y el mosto de la variedad Bonarda con 0,3 μg/l de la toxina. Se colectaron muestras durante los diferentes estadios del proceso de vinificación. Se estableció el avance de dicho proceso sobre la base de la evolución de las fermentaciones alcohólica y maloláctica. Se determinó la acidez total y volátil, el pH y el contenido de etanol, de azúcar y de SO2 siguiendo los protocolos estándares propuestos por la Oficina Internacional de la Vid y el Vino (OIV). El contenido de OTA se evaluó por HPLC. Los límites de detección y cuantificación fueron 0,01 y 0,1 ng/ml, respectivamente. Los niveles de OTA disminuyeron alrededor del 86,5% al final del proceso de vinificación. El tipo de cepa de Saccharomyces spp. utilizada no tuvo efecto sobre la reducción de OTA.

Aspectos relacionados à presença de fungos toxigênicos em uvas e ocratoxina A em vinhos / Aspects related to the presence of toxigenic fungi in grapes and ochratoxin A in wines

A colonização dos Aspergillus da secção Nigri nas uvas durante o cultivo é a principal fonte de ocratoxina A (OTA) nos vinhos. A. carbonarius e A. niger são os principais produtores desta micotoxina em uvas e são fungos oportunistas que, se desenvolvem, principalmente, nas bagas danificadas durante seu amadurecimento. A produção de OTA em uvas é influenciada pelas condições climáticas e áreas geográficas, bem como pela variedade de uva, pelo sistema de cultivo e pelos danos causados nas uvas por insetos, infecção fúngica ou excesso de irrigação e chuva. As medidas para o controle de fungos toxigênicos devem considerar esses pontos críticos de controle. A OTA presente nas uvas é transferida para o vinho durante o processo de vinificação, sendo que um aumento na concentração de OTA ocorre após a maceração das uvas. Durante o envelhecimento do vinho, observa-se que a toxina permanece estável, pois a mesma concentração de OTA é encontrada no vinho após um ano de armazenamento. Boas práticas de produção, como, por exemplo, a seleção e separação dos cachos de uva com desenvolvimento fúngico visível auxilia, consideravelmente, na redução dos níveis de contaminação por fungos produtores de OTA, bem como dos níveis dessa micotoxina nos vinhos.

The infection of grapes by 'black aspergilli' in the field is the main source of ochratoxin A (OTA) in the wine. Aspergillus carbonarius and A. niger fungi are the main producers of this mycotoxin in grapes. They are opportunistic fungi that develop mainly on damaged berries at ripening. The production of OTA in grapes is influenced by climatic conditions, geographical location, grape varieties, crop system, berries damage caused by insets, fungal infection or excessive irrigation and rainfall. Control measures for toxigenic mycoflora in the vineyards must consider these critical control points. OTA in grapes is transferred to wine during vinification and an increase of OTA concentration in must was observed during maceration. The toxin remains stable during wine aging because the same OTA concentration is found in wine after 1 year. Good Agriculture Practices including balanced soil tillage, irrigation, nitrogen fertilization and pruning associated with Good Manufacturing Practices, such as separation of rot bunches helps considerably to reduce OTA-producing fungi and levels of mycotoxin in wine.

Ocratoxina A em café torrado e moído comercializado em Minas Gerais - 2006 / Ochratoxin A in roasted and ground coffee commercialized in Minas Gerais – 2006

Ocratoxina A (OTA) é uma das mais importantes micotoxinas de interesse para a saúde humana. OTA é potencialmente nefrotóxica, teratogênica e imunotóxica, afetando particularmente o sistema renal. É produzida por três espécies principais de fungos: Aspergillus ochraceus, Aspergillus carbonarius e Penicillium verrucosum, com uma menor contribuição para Aspergillus niger. O café é produzido em países tropicais onde condições climáticas são favoráveis ao crescimento de fungos e produção de micotoxinas como OTA. Para avaliar a concentração de OTA em café torrado e moído consumido no estado de Minas Gerais (Brasil), 45 amostras foram coletadas pela Vigilância Sanitária do Estado de Minas Gerais, em 2006. A toxina foi isolada por coluna de imunoafinidade e quantificada por cromatografia líquida de alta eficiência, utilizando detector de fluorescência. (...) Os resultados revelaram que o nível de contaminação de OTA em café não foi significativa.

Determinación de ocratoxina A en plasma humano y en café de Costa Rica por un método de ELISA / Ocratoxin A in human plasma and coffee from Costa Rica by ELISA

Costa Rica no es la excepción en cuanto a la prevalencia de ocratoxina A en plasma, ya que en este estudio se obtuvo la presencia de la micotoxina en el 95% de las 149 muestras estudiadas. También se estudió la presencia de la ocratoxina A en 110 muestras de diferentes marcas de café tostado y molido de las 12 torrefactoras más importantes del país y de 7 supermercados. A excepción de una muestra de café que dio resultados negativos, el resto de muestras analizadas presentaron la micotoxina en cantidades menores a 4000 ng/L o kg. Se trató de encontrar una asociación entre el consumo de café y la presencia de la ocratoxina A en el plasma así como del consumo de cerveza, sin embargo no hubo diferencia estadísticamente significativa en el valor promedio de la micotoxina entre los tomadores y no tomadores de café y tampoco entre los bebedores y no bebedores de cerveza.

Ocratoxin A in human plasma and coffee from Costa Rica by ELISA. Costa Rica is not an exception in the prevalence of ochratoxin A in human plasma, in this research the presence of the micotoxin was found in 95% of the 149 samples studied. The presence of ocratoxina A also was studied in 110 samples of toasted and grounded coffee from the most important 12 coffee factories of the country and from 7 supermarkets. With the exception of one negative sample the rest of them have concentrations of micotoxin below 4000 ng/kg. An association between the coffee consumption and the presence of ochratoxin A in plasma was attempted to be found as well as in the consumption of beer, but there were any statistically significant difference in the average level of mycotoxin between the coffee consumers and non coffee consumers neither between beer consumers and no beer consumers.

Perfil leucocitário de frangos de corte tratados com ocratoxina A / Leucocytes of broilers chickens treated with ochratoxin A

Alterações leucocitárias provocadas pela administração única de baixa dose de ocratoxina A foram avaliadas em 120 pintos deum dia da linhagem comercial de corte Hiyeld/Rezende. Os animais foram separados em três grupos experimentais: grupo 1(n=40) sem tratamento; grupo 2 (n=40) tratado com 40mg/Kg ocratoxina A e grupo 3 (n=40) tratado com solução salinatamponada. As amostras de sangue foram obtidas e analisadas no dia da aplicação, aos sete, 14 e 21 dias de vida. Foiobservada uma redução significativa (p<0,01) de leucócitos mononucleares (linfócitos e monócitos) nas aves tratadas comocratoxina A, caracterizando toxidez aguda decorrente da exposição à baixa dose da micotoxina em aves neonatas, após umaúnica exposição.

Leucocytes dysfunction caused by the administration of a single low dose of ochratoxin A (OTA) was evaluated in 120 one day oldchicks from broiler line HIYIELD/REZENDE. The study was carried out in three groups of animals: group 1 (n=40) with treatedanimals; group 2 (n=40) with animals treated with OTA and group 3 (n= 40), which received a phosphate buffered saline (PBS).Blood samples were obtained and analyzed in the same day of inoculation, and at seven, 14th and 21st days old. A significantreduction of mononuclear leukocytes was observed in the birds treated with OTA, suggesting an acute toxicity as a result of theexposure to a single low dose of OTA in neonatal chicks.

Evaluation of Brazilian terrestrial Aspergillus strains for Mycotoxin production / Avaliação de linhagens terrestres brasileiras de Aspergillus paraprodução de micotoxinas

Screening tests for aflatoxins B1, B2, G1 and G2, ochratoxin A and sterigmatocystin production were performed in 13 strains of Aspergillus spp, isolated from the terrestrial environment in the Brazilian Atlantic Rainforest (São Paulo State/Brazil). Coconut agar medium and moistened corn were employed as substrates. The fungal extracts obtained from both media were submitted to thin-layer chromatography and the toxins were estimated according to the intensity of their fluorescence observed under UV light. None of the tested strains presented any of the mentioned mycotoxins. Because many unknown fluorescente spots were present, it was necessary to proceed a confirmation step using multiple chromatography, two dimensional chromatography and derivatization. In view of the accuracy of the employed methods and the presence of many unknown fluorescent spots, the need of further studies on the production of others mycotoxins of fungi isolated under tropical conditions is justified. (AU)

Testes de triagem para verificar a produção de aflatoxinas B1, B2, G1 e G2, ocratoxina A eesterigmatocistina foram conduzidos em 13 linhagens de Aspergillus spp, isoladas do ambiente terrestreda Mata Atlântica Brasileira (SP/Brasil). Os meios de agar côco e milho umidificado foram os substratostestados neste estudo. Os extratos dos fungos obtidos a partir dos dois substratos foram submetidos àcromatografia em camada delgada e as micotoxinas estimadas de acordo com as fluorescências apresentadassob luz ultravioleta. Nenhuma das linhagens testadas apresentou produção das micotoxinas mencionadas. Foi necessário acrescentar uma etapa de confirmação, usando múltipla cromatografia, cromatografia bidimensional e derivação. Tendo em vista a eficiência da metodologia aqui empregada e da presença de muitos pontos fluorescentes desconhecidos, justifica-se a necessidade da ampliação dos estudos sobrea produção de outras micotoxinas em fungos isolados de ambientes tropicais. (AU)

Avaliaçäo de métodos para determinaçäo de ocratoxina A em Cafés verdes e torrados / Evaluation of methods for ochratoxin A determination in green and roasted coffees

Diferentes solventes de extraçäo, assim como técnicas para limpeza de extratos para determinaçäo de micotoxinas, tanto clássicas (clarificaçäo, partiçäo) como aquelas envolvendo colunas para extraçäo em fase sólida (sílica, octadecilsilil e imunoafinidade) foram avaliadas para determinaçäo de ocratoxina A em café verde e torrado. Apenas as colunas de imunoafinidade foram capazes de remover os interferentes existentes nos extratos de café permitindo a determinaçäo de ocratoxina A por cromatografia líquida de alta eficiência com detecçäo por fluorescencia em níveis de 0,7 ng/g. Colunas de imunoafinidade de duas marcas diferentes foram testadas com relaçäo à recuperaçäo da toxina e à reutilizaçäo em outras análises. Colunas de uma segunda marca apresentaram recuperaçäo média de 73(por cento) no primeiro uso e abaixo de 30(por cento) no segundo. (AU)

Different extraction solventes and cIeanup techniques for mycotoxins determination Were evaluated for green and roasted coffee. Classical techniques such as partition and cIarification as well as solid phase extraction (silica, octadecylsilyl, Cianopropyl and immunoaffinity columns) were tested. Only immunoaffinity Columns were capable to effectively remove interferentes frorn coffee Extracts allowing ochratoxin A to be determined by HPLC and fluorescence Detection at levels of 0,7 ng/g. Two comercial brands of immunoaffinity Columns were evaluated for ochratoxin A recovery and repeated use. Average Recovery for one brand was 97% and was above 70% on the fourth use. Average recovery for a second brand was 73% on the first use and below 30% on the second use. (AU)

Ocorrência de aflatoxinas, ocratoxina A e zearalenoma em milho de Minas Gerais: Parte I / Ocorrência de aflatoxinas, ocratoxina A e zearalenona em milho de Minas Gerais. Parte 1

Em amostras de milho em grão, safra 1984, coletadas em diversas localidades do Estado de Minas Gerais, foi verificada a incidência de aflatoxinas, ocratoxina A e zearalenona. Foi utilizada a técnica de cromatografia em camada delgada. Das 83 amostras analisadas, 15 apresentaram aflatoxinas e apenas uma apresentou zearalenona. Não foi detectada ocratoxina A em nenhuma das amostras (AU).